浙贝母的抗炎和抗腹泻作用
陕西省中医药研究院中药所(710003)张明发等
主题词 浙贝母/药理学
我们在研究炎症与腹泻的关系时，提出了一个止泻新理论:“炎症介质是一类致泻性自体活性物质，临床所见的大多数腹泻性疾病(包括感染性和非感染性)和泻药都是由于致病因子使肠道发生炎症，释放出各种炎症介质所致。因此药物可以通过抗炎，如抑制炎症的发生、发展或炎症介质的合成、释放，或对抗炎症介质的泻下作用，产生止泻效果”(1-3)。本文报告浙贝母的抗炎、抗腹泻作用，以验证此理论。
１、材料
浙贝母购自陕西省药材公司，经我所生药研究室鉴定为百合科植物浙贝母FritillariathunbergiiMiq的干燥鳞茎。将其碾碎，用75%乙醇每天热回流提取8h，共3次。提取液减压回收乙醇，在水浴上浓缩成1g生药/ml，供实验用。乙柳酰胺(ethenzamide)系陕西省医药工业研究所附属二厂产品；阿斯匹林系无锡华瑞制药有限公司产品，角叉菜胶系辽宁省药物研究所产品，依文思蓝系上海新中化学厂产品，硫酸阿托品系上海第十制药厂产品，蓖麻油系吉林通辽油脂化工厂产品。番泻叶购自我院附属医院药房，经本所生药研究室鉴定为狭叶番泻树CassiaangustifoliaVahl.叶。番泻叶50g，加开水400ml煮沸5min，纱布过滤，在水浴上浓缩成1g生药/ml，供次日实验用。ICR小鼠由西安医科大学实验动物中心提供。
２、方法和结果
2.1抗炎作用
2.1.1对二甲苯性小鼠耳肿的影响 ICR小鼠40只，♀♂各半，体重25.6±1.4g，分为4组，分别ig浙贝母、乙柳酰胺或自来水，每天1次，连续3天，于末次给药前，用千分卡尺测量每只小鼠右耳厚度，作为正常值，末次给药后0.5h在右耳背上涂20μl二甲苯，并分别于涂后0.5、1、2、3、4h测量右耳厚度。致炎前后的厚度差即为耳肿胀值。在同一时相进行给药组与自来水对照组肿胀值的t检验。从表1可以看出浙贝母两剂量组都有抗二甲苯性小鼠耳肿胀作用。
2.1.2对角叉菜胶性小鼠足跖肿胀的影响 ICR小鼠40只，♂，体重22.0±1.6g，分为4组，分别ig浙贝母、乙柳酰胺或自来水，每天1次，连续3天。末次ig后立即在右足跖SC1%角叉菜胶50μl，用千分卡尺测量右后足跖厚度，每隔1h测量1次，共6h。以致炎前后的厚度差作为肿胀值，在同一时相进行组间t检验。结果两剂量组的浙贝母都抑制角叉菜胶引起的小鼠足跖肿胀。
2.1.3对乙酸提高小鼠腹腔毛细血管通透性影响 ICR小鼠44只，♀♂皆用，体重20.1±2.0g，分为4组，分别ig浙贝母、阿斯匹林或自来水，每天1次，连续3天。末次ig后0.5h，iv0.5%伊文思蓝5ml/kg，5min后ip0.7%乙酸10ml/kg，再过0.5h处死小鼠，用10ml生理盐水冲洗腹腔，洗液在590nm波长处比色(4)。结果洗液中依文思蓝含量(μg/ml):自来水对照组为6.5±3.4，ig阿斯匹林0.3g/kg、浙贝母75%醇提物0.8和2.4g/kg组分别为2.2±1.2(P<0.01)、3.9±1.5(P<0.05)和3.8±1.9(P<0.05)，抑制率分别为66.2%、40.0%和41.5%，都抑制乙酸提高小鼠腹腔毛细血管通透性。
2.2抗腹泻作用
2.2.1对蓖麻油性腹泻的影响 ICR小鼠40只，♀♂各半，体重21.5±2.1g，分为4组，分别ig浙贝母、乙柳酰胺或自来水后0.5h，ig蓖麻油0.15ml/只，分别单个放在垫有直径约15cm报纸的小桶内，每隔1h换垫纸，共观察8h，按文献(4)判别和统计腹泻次数和发生率。浙贝母有强而持久的抗蓖麻油性腹泻作用。
2.2.2对番泻叶性腹泻的影响 ICR小鼠40只，♀♂各半，体重20.5±1.4g，分为4组，分别ig浙贝母、乙柳酰胺或自来水后0.5h，ig番泻叶0.4g/只，以后实验过程同上。结果表明，浙贝母2.4g/kg组才能显著抑制番泻叶引起的小鼠腹泻，且作用仅持续4h。
2.3对小鼠墨汁胃肠推进运动的影响 ICR小鼠40只，♀♂皆用，体重19.6±2.0g，分为4组，禁食不禁水16h，分别ig浙贝母、阿托品或自来水后1h，ig墨汁0.15ml/只，20min后处死，按文献(4)测定墨汁胃肠推进运动，计算推进率和抑制率。结果自来水对照组的胃肠推进率为58±12%，硫酸阿托品10mg/kg、浙贝母75%醇提物0.8和2.4g/kg组分别为46±11%(P<0.05)、66±12%和51±18%(P均>0.05)。抑制率分别为20.7%、—13.8%和12.1%。浙贝母不影响小鼠胃肠推进运动。
３、讨论
本研究首先发现浙贝母具有较强的抗急性渗出性炎症作用，这可能是浙贝母散结解毒，治呼吸道炎症以及疮疡肿毒的部分药理学基础，蓖麻油是通过刺激小肠引起小肠炎症，番泻叶是通过刺激大肠引起炎症产生腹泻(2)。浙贝母对这两种腹泻都有抑制作用，对番泻叶性腹泻作用弱而短的原因，可能与ig后药物被小肠吸收，使到达大肠的药物量大减有关。由于浙贝母不抑制小鼠胃肠推进运动，而乙柳酰胺系非甾体类抗炎药，本文也证明其有抗腹泻作用，因此通过抗炎抑制炎症发生和发展可能是浙贝母的抗腹泻机理。
参考文献
１、张明发、赵更生.炎症介质与腹泻性疾病.基础医学与临床，1992；12(3):151
２、张明发.泻药与炎症介质.西北药学杂志，1993；8(1):40
３、张明发.抗炎药物的抗腹泻作用研究进展.西北药学杂志，1993；8(3):133
４、张明发、沈雅琴.小檗碱的抗腹泻和抗炎作用.中国药理学报，1989；10(2):174
(收稿日期:1998年7月13日)
黄花倒水莲对乙肝病毒E抗原体外抑制作用的初步观察
湖南省儿童医院(410007)李梨平 王伟华*
主题词@黄花倒水莲/药理学乙肝病毒E抗原/药物作用
黄花倒水莲对乙肝病毒表面抗原(HBsAg)具有体外抑制作用(1)，为了探讨其是否对乙肝病毒(HBV)有比较全面的体外抑制作用，我们对其进行了体外抑制HBeAg的实验，现将结果报道如下。
１、材料与方法
1.1药物制备 黄花倒水莲生药由湖南中医学院药学分院提供，按通常煎煮方法将生药置三角烧瓶内，加适量蒸馏水浸泡30min，在火上加热煮沸15～20min，冷却后经纱布过滤去渣并浓缩成10%(每100ml含生药10mg)剂量的药液(原液)，4℃保存备用。
1.2HBeAg阳性血清 HBeAg阳性血清由湖南省儿童医院传染科提供。通过反向间接血凝抑制实验(RPHI)选用HBeAg滴度在1:800～1:3200的血清，并用中和实验证实。将阳性血清混匀，置超低温冰箱(美国HARRIS公司生产)-70℃冻存。实验前再经ELISA实验证实为HBeAg强阳性。
1.3试剂 HBeAgELISA试剂盒购自华美生物工程有限公司，批号为970608。
1.4主要仪器 DG-3022A型酶联免疫检测仪，华东电子管厂生产。
1.5实验方法 参照文献(2)改进而成。
1.5.1药物分为原液(药物浓度为10mg/100ml)，1:2稀释(5.0mg/100ml)，1:4稀释(2.5mg/100ml)3个剂量组。
1.5.2血清分为原液，1:2稀释，1:4稀释3组。
1.5.3作用时间分为1h，2h，4h3组。
1.5.4实验过程取不同浓度药液加入96孔细胞培养板中，以生理盐水(NS)作为阴性对照，“84”消毒液作为阳性对照，每组均做20孔。每孔均加入1:2稀释的HBeAg阳性血清50μl，震荡混匀后置37℃培养箱内接触4h。
将未经稀释(原液)、2倍(1:2)及4倍(1:4)稀释的HBeAg阳性血清50μl加入96孔细胞培养板孔内，每组20孔，分别加入药物原液50μl，37℃接触4h。
将药物原液50μl加入96孔培养板孔内，再加入1:2稀释的HBeAg阳性血清50μl，37℃分别接触1h、2h和4h，每一时间均作20孔。
上述各组达到预定接触时间后，吸取50μl药物与血清的混合液加入到已预包被处理好的酶标板孔内(试剂盒已提供)，按试剂盒说明书继续操作。最后在酶标仪上使用波长492nm滤光片，经空白孔调零后检测。将所测得的每组(吸光度)OD值进行均数t检验。
２、结果
2.1不同药物剂量对抑制能力的影响 血清稀释度(1:2)与接触时间(4h)不变，黄花倒水莲水煎液3个不同剂量组(原液、1:2稀释、1:4稀释)的吸光度值(OD值)与NS对照组相比，具有明显差异(P均<0.05)，而且3个不同剂量之间两两比较，亦有明显差异(P<0.05)，结果见表1。
表1 不同剂量药物对HBeAg抑制作用的观察
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药物剂量 孔数 OD值(X±S) P值
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NS对照 20 0.67±0.03
原液 20 0.40±0.02 <0.05
1:2稀释 20 0.50±0.03* <0.05
1:4稀释 20 0.60±0.03△ <0.05
“84”消毒液 20 0.12±0.01
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*和原液相比，P<0.05;△和原液及1:2稀释相比，P均<0.05。
2.2HBeAg不同滴度对药物抑制能力的影响 HBeAg阳性血清未经稀释(原液)、2倍及4倍稀释时，药物浓度(原液)与接触时间(4h)不变，其抑制能力3组间两两比较，具有明显差异(P<0.05)，见表2。
表2 不同HBeAg滴度对药物抑制作用的影响
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HBeAg滴度 孔数 OD值(X±S)
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原液 20 0.52±0.03
1:2稀释 20 0.40±0.02*
1:4稀释 20 0.32±0.02△
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*和原液相比，P<0.05;△和原液及1:2稀释相比，P均<0.05。
2.3不同接触时间对药物抑制能力的影响 药物浓度(原液)与HBeAg滴度(1:2)不变时，1h、2h、4h3组之间，随着接触时间延长，其OD值逐渐降低，经两两比较发现不同接触时间组之间有显著性差异(P<0.05)，见表3。
表3 不同接触时间对药物抑制作用的影响
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接触时间 孔数 OD值(X±S)
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1h 20 0.55±0.04
2h 20 0.48±0.02*
4h 20 0.40±0.02△
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*和1h相比，P<0.05;△和1h及2h相比，P均<0.05。
３、讨论
黄花倒水莲水煎液3种不同浓度对乙肝病毒HBeAg均具有体外抑制作用，但随着药物稀释度的增加(亦即浓度降低)，其OD值逐渐增加，且差异具有显著性。说明药物浓度越低对HBeAg的体外抑制作用越弱，提示在服用黄花倒水莲口服液时，应注意有效浓度，不要过度稀释。
HBeAg阳性血清无论是否稀释，黄花倒水莲水煎液对其均具有明显的体外抑制作用，但是当HBeAg稀释度逐渐增大时，抑制作用亦逐渐增强。因HBeAg是HBV的复制指标之一，HBeAg滴度高说明HBV复制活跃，病毒数量多，反之亦然。据此可推测黄花倒水莲对血清HBeAg低滴度的患者，亦即HBV低复制、病毒数量少的人其疗效可能优于HBV高复制者。
药物与病毒接触时间越长则抑制作用越强。
中草药对乙肝病毒体外抑制作用的报道较多(3-5)。黄花倒水莲(Polygalaaureocaudadunn)为远志科植物黄花倒水莲全草，我们曾经报道过黄花倒水莲水煎液对HBsAg的体外抑制作用(1)，从本实验结果初步看来，黄花倒水莲水煎液对HBeAg亦具有一定程度的体外抑制作用，这为扩大黄花倒水莲的临床适应证提供了初步的实验依据。但体外抑制实验受“体外”及方法的局限，黄花倒水莲进入体内后对HBV是否仍具有抑制作用，尚须进一步探讨。
参考文献
１、王伟华，褚裕义，刘伟士，等.黄花倒水莲对乙肝病毒体外抑制作用的初步观察.湖南中医药导报，1996;2(6):31
２、Zheng Minshi，etal.An experimental study on a Vast Scule on HBsAg Inhibition Using
1000 Herbs.The Microbiological Journal，1990;1(3):29
３、郑民实.ELISA技术检测中草药抗HBsAg.中西医结合杂志，1990;10(9):560
４、杨斌武.中药对HBsAg抑制作用的观察.甘肃中医学院学报，1993;10(2):52
５、蒋锡源.50种治疗肝炎中草药与制剂体外抑制HBsAg活性的比较.现代应用药学，1992;9(5):208
(收稿日期:1998年8月3日)
TLC及柱层析法分离栀子甙的比较
湖南长沙市药品检验所(410004)李立荣等
主题词 薄层层析法栀子甙/分析柱层析法
栀子来源于茜草科植物栀子GardeniajasmionidesEills的成熟果实，栀子化学成分复杂，有效成分主要为8种栀子甙类化合物，它们都是环烯醚萜甙类，结构较相似，一般方法难以从中分离出栀子甙单体，据文献报道:用柱层析和薄层层析来分离，都很理想地分离出了栀子甙单体。有文章载:栀子甙的95%的乙醇溶液，在237nm处有最大吸收峰。通过对这两种不同分离方法分离所得栀子甙的紫外吸收度的测定，分别计算出所得含量，由含量值来比较这两种分离方法的优劣。
１、实验条件
药材:栀子(购于药材市场)。仪器:岛津UV-265FW型自动记录紫外分光光度计，万分之一全自动电光天平。试剂:甲醇、乙醇、正丁醇、氯仿、高锰酸钾等为AR级，中性氧化铝(100-200目)，硅胶G(青岛海洋化工厂)，活性炭150℃活化4h，栀子甙标准品:中国药品生物制品检定所出品。层析法:活性炭与氧化铝按0.5:2的质量比例混匀，装柱，柱长10cm，柱径1cm。硅胶G板:硅胶G加3倍量蒸馏水研合均匀，板厚约0.5mm，105℃活化30min。
２、实验方法
2.1标准曲线的制备 精密称取栀子甙标准品5.0mg，溶于95%乙醇中，定容于25ml容量瓶中，精密移取0.0ml，0.5ml，1.5ml，2.0ml，2.5ml放于10ml容量瓶中，稀释至刻度，于237nm处作标准曲线。
线性方程:CONE=ABS＊K+B，K=0.0407，B=-0.0005，相关系数R＊＊2=0.99992.2样品液的制备精密称定栀子粉末2.0g，置沙氏提取器中，用70ml甲醇回流提取直至提取器中甲醇液呈无色，取出冷却，然后将提取液定容于100ml量瓶中，待用。
(1)柱层析法:精密移出备用液10ml，水浴上挥干甲醇，残渣加5ml水溶解，水液用30ml，10ml，20ml，10ml水饱和过的正丁醇萃取直至萃取液无色，合并萃取液，水浴上挥干，残渣加甲醇溶解完全，进入柱层析。用甲醇100ml洗脱，洗脱速度3～5滴/min，收集洗脱液，水浴上挥干甲醇，残渣用95%的乙醇溶解完全，定容到100ml，备用。
(2)薄层层析法:精密移取0.015ml栀子甲醇提取液，点样于硅胶G薄层板上，同样取栀子甙标准品甲醇溶液，点于同一块的另一侧，以用来对照定位，然后按薄层层析法，以氯仿:甲醇(3:1)为展开剂，展距15cm左右，取出凉干，用一干净玻璃板盖住样品一侧，在对照品一侧，用1‰高锰酸钾中性水溶液染色，则见在淡红色底色上呈现一亮黄色斑点，小心刮取样品一侧相对于对照品斑点位置的一小块硅胶G，用95%的乙醇约5ml提取，G4垂熔漏斗抽滤，滤液定容于10ml量瓶中，待用。
2.3样品测定 根据紫外分光光度法，将样品溶液在237nm处测定吸收度和吸收峰，通过扫描，两种样品液在237nm处都可见一吸收峰。
2.4稳定性实验 取栀子甙对照品的95%的乙醇溶液，每隔一定时间测1次吸收峰位置和吸收度，经测定发现，该溶液放置若干天，吸收峰位置和吸收度基本没有变化。
３、讨论
以上实验结果说明，薄层层析法所测得的含量值比附表两种分离方法测得栀子甙的含量比柱层析法稍高一些，但其相对误差比柱层析法大。这主要是由于:薄层层析法操作简单，步骤少，流程短，其操作精度要求高。而柱层析法则操作较繁琐，流程长，有效成分损失相对增多，再通过萃取和多次转容有效成分又会有所损耗，洗脱时，有效成分也有被滞留。若超量洗脱，又有可能使其它成分混入，不过，从另一方面来讲，这些都可能通过改进吸附剂的质量来改善，并且，柱层析有着分离量多，相对误差小的优点。因此，在检测药物成分和测定含量时，可首选薄层层析法，既简单、准确性也好，但在制药工业中，柱层析法的应用范围广泛得多了。在实际工作中，应根据实际情况，以分辩率最高、重现性最佳为目标，灵活应用不同的分离方法。
(收稿日期:1998年1月4日) |